Antonia Ricci, Serena Amato, Lisa Barco
Centro Nazionale di Referenza per le Salmonellosi, Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie, Legnaro (PD)
Introduzione
I dati di seguito presentati sono stati ottenuti nell’ambito del Piano Triennale per la Sicurezza Alimentare della regione Veneto (2002-2004), che prevedeva, fra i suoi obiettivi generali, l’attivazione di sistemi di sorveglianza e monitoraggio in grado di fornire dati attendibili sulla situazione sanitaria degli allevamenti e sul livello di contaminazione degli alimenti.Tale esigenza è nata dalla necessità di attuare un controllo delle zoonosi a trasmissione alimentare adottando un approccio di filiera, che vede la fase di allevamento come momento critico di diffusione della contaminazione e quindi come punto cardine delle attività di controllo.
La definizione di campionamenti basati su criteri statistici e la successiva realizzazione di tali piani di monitoraggio, relativi ai principali patogeni alimentari (Salmonella e Campylobacter) nelle specie animali di interesse zootecnico (bovini, suini, polli, tacchini, galline ovaiole) macellate sul territorio regionale, hanno permesso definire la situazione sanitaria degli allevamenti, riuscendo quindi a soddisfare quanto previsto dalla Direttiva 2003/99/CE e dal Regolamento (CE) 2160/2003 (Anonimo, 2003 a, b). Tale normativa, sul monitoraggio delle zoonosi e degli agenti zoonotici, richiede infatti ai Paesi Membri di raccogliere dati pertinenti e comparabili al fine di identificare e caratterizzare i pericoli, e di definire i rischi legati all’esposizione ad agenti zoonotici. L’obiettivo di tale attività di sorveglianza è quello di rendere possibile la valutazione delle tendenze e delle fonti delle zoonosi nella Comunità, e di fornire dati su cui poter improntare la valutazione del rischio rappresentato da questi agenti patogeni.
Ai sensi della Direttiva, la sorveglianza viene attuata nella fase o nelle fasi della catena alimentare più appropriate in funzione della zoonosi o dell’agente zoonotico in questione, e quindi a livello di produzione primaria e/o in altre fasi della catena alimentare, compresa la produzione di prodotti alimentari e mangimi. La sorveglianza riguarda obbligatoriamente le malattie e gli agenti zoonotici elencati nell’allegato I, parte A, tra cui sono elencati anche patogeni a trasmissione prevalentemente alimentare quali Salmonella, Campylobacter, Listeria, Escherichia coli VTEC.
L’esperienza condotta nella Regione Veneto, già a partire dal 2002 e di seguito presentata può essere considerata quindi un primo esempio di applicazione della normativa comunitaria in materia di zoonosi.
L’obiettivo di questa presentazione è quello di riportare i metodi epidemiologici utilizzati per l’applicazione della nuova normativa sulle zoonosi, il piano di campionamento adottato per definire la prevalenza di Campylobacter nei broiler, le metodiche di laboratorio impiegate per l’isolamento del patogeno ed infine i dati di prevalenza ottenuti .
Materiali e metodi
Schema di campionamento
I campionamenti sono stati eseguiti presso 12 stabilimenti di macellazione localizzati nella regione Veneto e con una capacità superiore a 1 milione capi/anno.
La numerosità campionaria nel primo anno di attività (2002-2003) è stata pari a 150 partite. Il piano di campionamento prevedeva il prelievo per ciascuna partita di 3 tamponi cloacali, sottoposti ad analisi qualitativa in forma di pool, e di una carcassa. Sulla carcassa è stata eseguita sia la determinazione qualitativa che quantitativa di Campylobacter spp.
Durante il secondo anno di attività (2004) la numerosità campionaria è risultata pari a 212 partite, da ciascuna delle quali sono stati prelevati 10 tamponi cloacali, anche questi analizzati in pool.
Metodi di laboratorio
Analisi qualitativa tamponi cloacali: 3 tamponi per partita durante la prima fase del monitoraggio e 10 tamponi per partita durante la seconda fase di monitoraggio sono stati sottoposti ad prearricchimento in Brodo Preston (BIOLIFE: brodo nutriente n°2, supplemento di crescita per Campylobacter, supplemento selettivo per Campylobacter; sangue di cavallo lisato) secondo un fattore di diluizione 10; è stata impiegata come temperatura di incubazione 42°C per un tempo di 48h ed in condizioni di microaerofilia (O2 5%, CO2 10%, N2 85%).
Analisi qualitativa carcasse: 25 g di cute e tessuto muscolare, prelevati nella zona pettorale, sono stati sottoposti a prearrichimento in 225 ml di Brodo Preston ed incubati a 42°C per 48h in condizioni di microaerofilia.
Sia per i tamponi che per le carcasse dopo 48h di incubazione sono stati seminati 10 ml di brodocoltura in terreno solido selettivo modified-CCDA (OXOID: Campylobacter blood-free-selective agar base e ccda-selective-supplement). Al termine dell’incubazione, realizzata nelle medesime condizioni impiegate per la fase di prearrichimento, le colonie potenzialmente riferibili al genere Campylobacter spp. sono state reisolate in agar sangue e sottoposte a prove biochimiche di conferma. Attraverso PCR multipla è stato quindi possibile identificare i ceppi riferibili alle specie coli e jejuni.
Analisi quantitativa carcasse 10 g di cute, prelevati nella zona pettorale, sono stati sottoposti a prearrichimento in 90 ml di acqua peptonata tamponata per e lasciati riposare 15’. Dall’omogenato sono state allestite diluizioni seriali fino a 10-3 in acqua peptonata tamponata, quindi 1 ml di ciascuna delle diluizioni 10-1, 10-2 ,10-3 è stato seminato in triplice in 9 ml di brodo di arricchimento Preston ed incubato per 48h a 42 °C, in condizioni di microaerofilia. 10 μl di ciascuna serie di 3 tubi sono stati seminati in altrettante piastre di m-CCDA ed incubate nelle già citate condizioni. Si è quindi proceduto alla lettura delle piastre per rilevare la presenza di colonie sospette e determinare il valore di MPN/g secondo una tavola di riferimento.
Risultati
Durante il primo anno di attività l’analisi dei tamponi cloacali ha permesso di riscontrare positività per Campylobacter spp. in 125 partite delle 150 esaminate (prevalenza pari a 83,33%).
Sono stati isolati complessivamente 187 ceppi di cui 115 attribuibili alla specie jejuni e 54 alla specie coli, mentre per 18 campioni non è stato possibile determinare la specie di appartenenza, ma solo confermare il genere. Inoltre, in talune partite è stata riscontrata la presenza contemporanea di più specie.
Per quanto riguarda l’analisi qualitativa delle carcasse sono stati esaminati 276 campioni, riscontrando positività in 215 (prevalenza pari a 77,90%). I ceppi complessivamente isolati sono stati 241: 139 ascrivibili alla specie jejuni, 97 alla specie coli e 5 appartenenti ad altre specie.
75 carcasse sono state inoltre sottoposte all’analisi quantitativa; di queste il 46,67% presentava carica microbica inferiore a 110 MPN, il 29,33% compresa tra 110 e 1100 MPN/g ed il restante 24% superiore a 1100 MPN/g.
Nella seconda campagna di monitoraggio sono state esaminate 212 partite, 193 delle quali risultate positive (prevalenza pari a 91,04%). Sono stati isolati 199 ceppi, tutti, tranne uno, identificati a livello di specie (87 jejuni e 11 coli). Anche in questa fase è stato possibile riscontrare la contemporanea presenza di entrambe le specie in una stessa partita.
Discussione
L’attività di monitoraggio ha permesso di evidenziare le elevate prevalenze di Campylobacter nei polli da carne al momento della macellazione. Questi dati confermano la necessità di mettere in atto rigorose misure di biosicurezza per impedire l’introduzione del patogeno in allevamento. Infatti è ampiamente dimostrato che quando il microrganismo dall’ambiente o da altre fonti esterne riesce a colonizzare un animale, diffonde rapidamente tra tutti i soggetti del gruppo, raggiungendo prevalenze prossime al 100% nei soggetti al momento della macellazione (Shanker et al., 1990).
La quasi totalità dei ceppi isolati da polli risulta ascrivibile alle specie coli e jejuni, che rappresentano gli agenti principalmente responsabili degli episodi di campilobacteriosi umana. E’ stato inoltre possibile riscontrare come spesso coesistano specie differenti di Campylobacter in diversi gruppi tra quelli esaminati.
Prevalenze estremamente elevate sono state riscontrate anche nelle carcasse prelevate al termine delle operazioni di macellazione. Va tuttavia precisato che le carcasse campionate sono state prelevate prima di essere sottoposte a refrigerazione o congelamento, trattamenti che sembrano determinare una notevole riduzione nella contaminazione delle carni. (Rosenquist et al., 2006) Quindi, da un lato probabilmente il dato ottenuto risulta sovrastimato rispetto alla reale contaminazione delle carni avicole in commercio, dall’altro però non deve essere dimenticato che il Campylobacter è un microrganismo caratterizzato da dosi infettanti estremamente basse e quindi poche centinaia di cellule batteriche possono essere sufficienti a causare tossinfezione alimentare.
Sebbene in Italia non ci siano stime precise sulla reale incidenza delle infezioni umane sostenute da questo patogeno, le elevate prevalenze rilevate sulle popolazioni di polli da carne, principale serbatoio del microrganismo, fanno supporre che il Campylobacter rappresenti anche nel nostro paese, come in molti altri, uno dei principali, se non il primo agente di gastroenteriti umane (Moore et al., 2005).
Bibliografia
Anonimo (2003a) Directive 2003/99/EC of the European Parliament and of the Concil of 17 November 2003, on the monitoring of zoonoses and zoonotic agents, amending Council Decision 90/424/EEC and repealing Council Directive 92/117/EEC. OJ L 325/31, 12.12.2003.
Anonimo (2003b) Regulation (EC) No 2160/2003 of the European Parliament and of the Council of 17 November 2003 on the control of Salmonella and other specified food-borne zoonotic agents. OJ L 325/1, 12.12.2003.
Moore J.E. et al., (2005). Campylobacter. Vet.Res. 36 351-382
Rosenquist H., Sommer H.M., Nielsen, N.L., Christensen, B.B. (2006) The effect of slaughter operations on the contamination of chicken carcasses with thermotolerant Campylobacter. Int J Food Microbiol., Feb. 12 (Epub ahead of print).
Shanker, S., A. Lee, and T. C. Sorell. (1990) Horizontal transmission of Campylobacter jejuni amongst broiler chicks: experimental studies. Epidemiol. Infect. 104:101-110.